导读

朝鲜主要种植于地中海地区

朝鲜蓟为菊科菜蓟属多年生草本植物，朝鲜主要种植于地中海地区，蓟茎经细起源于野生多年生的叶中野生型刺菜蓟，是脂溶作用一种富含营养物质的保健蔬菜，被认为是性提一种功能性食品，具有缓解肝胆疾病及消化不良、取物抗氧化、对神抗菌、胞的保护抗癌等多种生理功能活性。朝鲜朝鲜蓟的蓟茎经细可食部分为内部苞片及花托，不可食用的叶中工业副产物部分包括其外部苞片及茎叶，占整个植株鲜重的脂溶作用80％左右，造成大量的性提土地占用、资源浪费及环境污染，取物因此对朝鲜蓟茎叶副产物的对神开发利用尤为重要。

萜类化合物是异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，而倍半萜化合物及三萜化合物是朝鲜蓟中主要的亲脂类化合物。Ramos等从刺菜蓟中提取了脂溶性成分并对其组分进行系统分析，其中去酰基菜蓟苦素、羽扇豆醇醋酸酯、ψ-蒲公英甾醇醋酸酯在栽培型刺菜蓟中均为第1次报道。有文献表明，萜类化合物具有抗高血脂圈、抗炎嘲、抗癌同等生理活性，然而截至目前，对朝鲜蓟副产物中萜类化合物的开发利用及相关活性的研究较少，对于其神经保护作用的报道更是不足。
大量研究表明，氧化应激诱导的神经细胞损伤与多种神经退行性疾病有关，如阿尔兹海默症和帕金森病等。在神经退行性疾病中，活性氧引起的氧化应激被广泛认为是神经细胞损伤的主要原因之一。现普遍认为，对中枢神经系统退化的有效治疗方法是保护神经细胞免受氧化损伤。有大量研究证明，许多天然抗氧化物都具有神经保护作用。

本研究采用GC-MS分析朝鲜蓟副产物脂溶性提取物中萜类及甾醇类化合物的组成与含量，通过测定不同指标研究脂溶性提取物对神经细胞的保护作用，为朝鲜蓟副产物的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

朝鲜蓟的茎叶等副产物于2018年4月份采自于中国云南省曲靖市陆良县中枢镇华侨农场，采收后当天立即空运送往实验室，液氮冷冻干燥、粉碎，过50目筛，装于自封袋中，于-20℃冰箱中保存。

正构烷烃(C7～C40)，上海安普实验科技股份有限公司；正十六烷(纯度>99.5％)、吡啶(纯度>99.9％)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；菜蓟苦素(纯度96.4％)、豆甾醇(纯度98％)、β-谷甾醇(纯度95％)、羽扇豆醇(纯度98％)，天津阿尔塔科技有限公司；α-香树脂醇(纯度≥98％)、β-香树脂醇(纯度≥98％)、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，美国Sigma-A1drich公司；三甲基氯硅烷(纯度>99％)、N，0-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(纯度96％)、二氯甲烷(分析纯级)，上海麦克林生化科技有限公司；30％H202溶液，国药集团化学有限公司；RPMll640培养基、青霉素-链霉素、0.25％胰蛋白酶，美国GIBCO公司；胎牛血清，美国HYCLONE公司；二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液、DPBS缓冲液、CCK8试剂盒、DCFH-DA试剂盒、吖啶橙-溴化乙锭(A0-EB)试剂盒，索莱宝生物科技有限公司；脂质氧化(MDA)试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

6890N/5973气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司：BDFACSEALIBUR型流式细胞仪，美国BD公司：YG-XD30型荧光显微镜，中国PVD公司；Tis型倒置相差显微镜，日本Nikon公司：InfiniteF50型酶标仪。澳大利亚TECAN公司。

1.3 脂溶性物质的提取

参考Romas等的方法并稍作修改。准确称取朝鲜蓟副产物冻干粉5g，加入125mL二氯甲烷，索氏提取7h。利用旋转蒸发仪在50℃下对提取液进行低压干燥，旋蒸后加入二氯甲烷对干燥后的提取物进行复溶，定容至25mL，取1mL氮吹至彻底干燥，于-20℃冰箱中保存。

1.4 GC-MS分析

参考Romas等的方法并稍作修改。在进行GC-MS检测之前，先进行三甲基硅烷化(TMS)衍生，向氮吹干燥后的脂溶性提取物中加入250μL含1mg正十六烷(内标)的吡啶，待提取物完全溶解后，加入250μL的N，O-双(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺和50μL的三甲基氯硅烷，混合物于70℃反应30min。

气相色谱-质谱联用仪配以DB-5J&W毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国安捷伦科技公司)，载气为高纯氦气(41cm/s)。色谱的操作条件为：自动进样，进样量1μL，进样口温度270℃，分流比30:1。柱温箱的升温程序为：初始温度120℃，保持2min，以4℃/min的速度升至250℃，而后以2℃/min的速度升至285℃，并保持15min。质谱的操作条件为：离子碰撞模式，离子能量70eV，以全扫描模式进行信息采集。扫描范围为，以30～600，离子源温度230℃。
GC-MS色谱图的处理软件采用MSDChem-Station工作站(Agilent，VersionE02)。定性时，通过将色谱峰的质谱信息与相关文献及工作站所匹配的NIST质谱库进行比较，必要时通过标样定性。定量时，主要的萜类及甾醇类化合物通过标曲定量。其余化合物通过内标(正十六烷)定量，结果均折算为样品中物质的含量，用mg/kgDM表示。

1.5 细胞培养

参考Tang等的方法并稍作修改。将PCI2细胞用完全培养基(RPMI1640培养基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)接种于6孔板中，接种密度3×105个/mL。接种量2mL/孔，置于37℃，5％CO2的水套式CO2孵育箱中培养24h。

1.6 细胞活力的测定

将PCI2细胞用完全培养基接种于96孔板中，接种密度3×105个/mL，接种量100μL/孔，于37℃，5％C02的孵育箱中培养24h。用不完全培养基(RPMI1640培养基，2％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)将脂溶性提取物稀释至高、中、低3个不同的质量浓度，分别处理PC12细胞8h后。加入含90μmol/LH202的不完全培养基培养4h。与预保护后伤害组相对应，以未经脂溶性提取物保护、经H202伤害的PCI2细胞作为模型组，以未经H2O2伤害、经高浓度脂溶性提取物处理的PCI2细胞作为脂溶性提取物保护组。以未经任何处理的PC12细胞作为空白对照组，利用CCK8法检测每孔中细胞的存活率，参考Ding等圈的方法，将处理后的细胞移除培养基，加入100μL/孔配好的CCK8工作液，置于5％CO2的孵育箱中，37℃孵育2h。酶标仪检测橘黄色甲臌的生产量。检测波长450nm处的吸光度值，每组做6个平行。

1.7 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测

细胞培养基中的LDH含量是衡量细胞损伤程度的重要指标，对按照1.5节方法培养好的细胞进行4组不同处理后，收集每孔中的培养基，按照试剂盒说明书检测培养基中LDH活性。

1.8 抗氧化活性的测定

氧化应激会直接或间接导致ROS介导的核酸、蛋白质和脂质损伤，并且涉及癌变圜、神经退行性病变幽、动脉粥样硬化、糖尿病圆和衰老陶等。在神经退行性疾病中，活性氧(ROS)引起的氧化应激被广泛认为是神经细胞损伤的主要原因之一，本研究利用2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针检测细胞内ROS水平。对按照1.5节方法培养好的细胞进行脂溶性提取物处理组、模型组、空白对照组3组处理后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化细胞，于4℃，1500r/min离心3min后使用完全培养基洗涤细胞，按照1:1000比例用无血清培养基(RPMll640培养基，1％青霉素-链霉素)稀释DCFH-DA。取0.5mL稀释液加入细胞，于CO2孵育箱中避光孵育20min，使用无血清培养基洗涤细胞3次，用荧光显微镜观察细胞荧光情况，并用流式细胞仪量化检测。检测条件为激发波长488nm。发射波长605nm。对按照1.5节方法培养好的细胞进行4组处理后，按照试剂盒说明书对细胞内丙二醛(MDA)水平进行检测，来确定脂质氧化的水平。

1.9 细胞凋亡的测定

对按照1.5节方法培养好的细胞进行预保护后伤害组、模型组、空白对照组3组处理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞。杜氏磷酸缓冲液(DPBS)洗涤细胞2次，加入500μL去离子水稀释好的结合缓冲液(1×)重悬细胞，上机前加入5μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和10μL碘化丙啶(PI)，室温避光反应10min，细胞流式仪量化检测，检测条件为激发波长488nm，发射波长530nm。对按照1.5节方法培养好的细胞进行预保护后伤害组、模型组、空白对照组3组处理后，向每个细胞处理组的培养基中加入40μLA0-EB染液，室温放置5min，荧光显微镜拍照观察。

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